檢測原理 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被肥胖抑制素（obestatin）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的肥胖抑制素（obestatin）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。 樣品收集、處理及保存方法 1. 血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。 2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。 3. 細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。 5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 自備物品 1. 酶標儀（450nm） 2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL 3. 37℃恒溫箱 操作注意事項 1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。 2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。 3. 濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經稀釋5倍，zui終結果乘以5才是樣本實際濃度。 4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。 5. 所有液體組分使用前充分搖勻。 試劑盒組成 | 名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 | | 微孔酶標板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無 | | 標準品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無 | | 樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 | | 檢測抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 | | 20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進行稀釋 | | 底物A | 6mL | 3mL | 無 | | 底物B | 6mL | 3mL | 無 | | 終止液 | 6mL | 3mL | 無 | | 封板膜 | 2張 | 2張 | 無 | | 說明書 | 1份 | 1份 | 無 | | 自封袋 | 1個 | 1個 | 無 | 注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、30、60、120、240、480 pg/mL 試劑的準備 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。 洗板方法 1. 手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。 2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。 操作步驟 1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。 2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL； 3. 樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。 4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。 5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。 6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。 7. 每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。 結果判斷 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。 試劑盒性能 1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。 2. 靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 pg/mL。 3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。 4. 重復性：板內、板間變異系數均小于15%。 5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。 6. 有效期：6個月 免責聲明 1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。 2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。 |
