一、原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗氯霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。
二、試劑盒技術(shù)指標(biāo)
試劑盒靈敏度： 0.05ppb
樣本定量檢測(cè)下限：
腸 衣————————————————0.1ppb 蜂 蜜———————————————— 0.1ppb
牛 奶————————————————0.05ppb
尿液、血清——————————————0.1ppb
組織、肝臟————————————— 0.025ppb
飼 料———————————————0.15ppb
樣本回收率：
組織、肝臟—————————————80%±10%
蜂蜜、腸衣—————————————70%±10%
牛奶、飼料—————————————85%±15%
尿液、血清———————————————70%±10%
交叉反應(yīng)率
氯霉素———————————————————100%
甲砜霉素————————————————— < 0.1%
氟甲砜霉素————————————————< 0.1%
三、 試劑盒組成
1、 微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條
2、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
3、 酶標(biāo)記物 12ml………………紅色帽
4、 抗體濃縮液 1ml…………………藍(lán)色帽
5、 底物 A 液 7ml……………… 白色帽
6、 底物 B 液 7 ml……………… 黑色帽
7、 終止液 7 ml……………… 黃色帽
8、 20X濃縮洗滌液 40ml………………白色帽
9、 2X濃縮復(fù)溶液 50ml………………透明帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：微孔板酶標(biāo)儀、氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：?jiǎn)蔚?20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、正己烷、去離子水、亞硝基鐵、硫酸鋅、葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）、醋酸鈉、醋酸
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí)，都必須注意：
（a）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、
禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。
（b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液1、C液（牛奶樣本使用）：
0.36M 亞硝基鐵（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）10.7g亞硝基鐵加去離子水100ml溶解。
配液2、D液（牛奶樣本使用）：
1M硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。
配液3、 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本使用）：稱2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。
配液4、乙腈-水溶液 V乙腈：VH2O＝84：16
配液5、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。（1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶）。
（a）組織、肝臟樣本前處理方法
1、 用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本；
2、 稱3±0.05g樣本于離心管中，先加入3ml去離子水充分混勻再加入6ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3、 取出4ml上層液體在氮?dú)饬?0-60℃水浴中干燥；
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。
5、 取50 µl下層相用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5
（b）血清血漿
1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min；
2、 靜置使水相與有機(jī)相分層或室溫4000r/min離心5min；
3、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?0℃水浴中干燥；
4、 殘留物用1 ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
（c）尿液
1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；
2、 加40µl葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)（或過夜）；
3、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min；
4、 室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮?dú)庀?0～60℃干燥；
5、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
6、 取50µl 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
（d）蜂蜜
1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml
去離子水溶解；
2、 加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min；
3、 室溫4000r/min以上離心10min；
4、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮?dú)饬飨赂稍铮?br />5、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解，混合30s；
6、 取50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測(cè)下限：0.025ppb
定量下限：0.1 ppb
注：我們推薦0.1 ppb為陽性樣本的cut off值。
（e）腸衣
1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本注：干樣本需剪碎（長(zhǎng)度不超5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上（去除表面的鹽份），瀝干后再進(jìn)行均質(zhì)。
2、 稱1±0.05g均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min。
3、 取出5ml上層液體（相當(dāng)于0.5g的樣本）在氮?dú)饬飨?0-60℃干燥。
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml稀釋后的復(fù)溶液強(qiáng)烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上，離心5min。
5、 去上層相，取下層50 µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1
（f）牛奶和奶粉
牛奶樣本處理方法一
1、 牛奶樣本，10℃4000r/min以上離心10min，吸除上層脂肪；
2、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中，加入150µlC液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150µlD液混合；
3、 15℃4000r/min以上，離心10min，移取上層液；
4、 用稀釋后的復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。
樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測(cè)下限：0.1ppb
定量下限：0.15ppb
牛奶樣本處理方法二
1、 取5ml去除脂肪奶樣至離心管中；
2、 加入250µlC液和250µlD液*混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如果沒有冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣本冷卻到8℃；
3、 轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液（相當(dāng)于2ml奶樣）至一
個(gè)新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振蕩5min；
4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ；
5、 轉(zhuǎn)移出2ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于1ml奶樣），60℃氮?dú)饬飨?干燥；
6、 用0.5ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
7、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5 檢測(cè)下限：0.025ppb
定量檢測(cè)限：0.05ppb
由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些
情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。
奶粉樣本處理方法
1、 稱2±0.05 g奶粉至離心管中，加入10ml去離子水，振蕩溶解；
2、 加1ml C液和1ml D液*混合。4-12℃4000r/min以上離心10min。若無冷凍離心機(jī)，請(qǐng)預(yù)先將樣本冷卻到8℃；
3、 轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液（相當(dāng)于0.6g奶粉）至一
個(gè)新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯上下來回
振蕩5min；
4、 室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min；
5、 轉(zhuǎn)移出4ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于0.4g奶粉），60℃氮?dú)饬飨?干燥；
6、 用0.4ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；
7、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：1 檢測(cè)下限：0.05ppb
定量檢測(cè)限：0.15ppb
由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。
（g）蛋類
1、 用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本（蛋黃或全蛋）；
2、 稱取3±0.05 g均質(zhì)過的樣本，與9ml乙腈-水溶液（84︰16；V乙腈︰V水）振蕩5min，15℃ 4000r/min以上離心10min；
3、 取3ml上層與3ml蒸餾水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯混合5min，15℃4000r/min以上離心10min；
4、 將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到試管中50℃下氮?dú)獯蹈桑?br />5、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除正己烷。
6、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2 檢測(cè)下限：0.1ppb
定量檢測(cè)限：0.3ppb
（h）飼料
1、 稱取2±0.05g均質(zhì)過的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；
2、 取2ml上層有機(jī)相到試管中56℃下氮?dú)獯蹈桑?br />3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s，離心去除上層正己烷。
4、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：3 檢測(cè)下限：0.15ppb
六、 酶標(biāo)免疫分析程序
測(cè)定前應(yīng)須知：
1、 使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4、 在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
操作步驟
1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 將濃縮抗體用已稀釋好的復(fù)溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液，按需配制使用）
6、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
7、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
8、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
9、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
10、測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含氯霉素成反比。
1、 粗略判定：
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍（ppb）。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.250，樣本2的吸光度值為0.720，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；0.05ppb為1.380；0.15ppb為1.100；0.45ppb為0.620；1.35ppb為0.289；4.05ppb為0.108。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb-4.05ppb；樣本2的濃度范圍是0.15 ppb-0.45 ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝B×100%
B0 B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />八、注意事項(xiàng)
1、 室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫
（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 試劑混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。
6、 將不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 試劑變質(zhì)的跡象
顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)放心使用。
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